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ELISA法&qPCR法,双管齐下——慢病毒滴度检测

发布者:酷游ku119网址 科技    发布时间:2021-04-20     
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【前情回顾】慢病毒包装Protocol大放送


慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种,基因组为双链RNA。慢病毒载体可以将外源基因有效整合到宿主染色体,从而达到持久性表达,区别于一般的逆转录病毒,慢病毒具有更广的宿主范围,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,对于较难转染 的多种细胞如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞、 非分化细胞等,均能极大提高目的基因的转导效率,具有广阔的应用前景。前面我们给大家详细的介绍过慢病毒包装的过程,今天我们再给大家细说一下在慢病毒包装、感染过程中不容忽视的慢病毒效力指标——慢病毒滴度。


Lentivirus.jpg


那么什么是病毒滴度呢?就像重组蛋白合成以后需要检测纯度一样,病毒包装后的效力如何,如何定量,也是必须要检测的,专业术语称为:病毒滴度的测定。慢病毒滴度是用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量,即每升溶液中含有的病毒数量。转导单位(TU)即能够感染并整合到细胞内的病毒载体基因组。常规生产的病毒的滴度在2x10E8TU/ml之间。所以,在慢病毒研究过程中,有效实现病毒滴度的检测显得尤为重要。下面我们就来聊下几种常见的慢病毒载体滴度的检测方法。


1.ELISA法检测病毒滴度


p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白。p24 ELISA法测量病毒上清液中p24衣壳蛋白的量,然后将p24的含量水平与病毒滴度关联起来。Cell Biolabs提供的基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分两种,一种称为传统的p24蛋白ELISA检测(Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)),能检测所有p24蛋白,从而实现对病毒滴度的定量,可检测1 ng/mL HIV p24蛋白,最后分光光度计读取数据。但是由于这种传统的p24 ELISA 法能检测所有p24蛋白,所以病毒滴度会偏高。同时Cell Biolabs提供的新的Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分离出包装细胞产生的游离p24蛋白,只检测病毒颗粒表面的p24,因此实验数据更真实准确,可检测1 ng /mL HIV p24蛋白,最后分光光度计读取数据。


传统的p24 ELISA可检测到293细胞在瞬时转染过程中产生的病毒相关p24和游离p24,而游离的p24可以占上清液中p24总量的很大一部分。因此,传统的p24 ELISA通常会高估存在的慢病毒的数量。新的QuickTiter慢病毒滴度试剂盒(与慢病毒相关的HIV p24)可最大程度地减少此问题。一项专有技术可在运行测定的ELISA部分之前,将慢病毒与溶液中的游离p24分离。


p24-ELISA.png

传统的p24 ELISA法


货号名称规格特点
VPK-108-HQuickTiter? HIV Lentivirus Quantitation Kit (p24 ELISA)96assays能检测所有p24蛋白(病毒颗粒表面的p24+游离的p24)
VPK-108-H-55x96 assays


新的p24 ELISA法


货号名称规格特点
VPK-107-TQuickTiter? Lentivirus Titer Kit (Lentivirus-Associated p24 ELISA)32 assays只检测病毒颗粒表面的p24
VPK-10796 assays
VPK-107-55 x 96 assays


2.Real-time PCR法检测病毒滴度


利用基于SYBRGreen的荧光定量PCR方法,PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,根据相应公式计算慢病毒滴度。


GeneCopoeia提供的Lenti-Pac?慢病毒滴度检测试剂盒系列产品为简便、快速检测慢病毒颗粒的滴度而设计。试剂盒包含从RNA抽提到qRT- PCR检测过程的全套试剂,样品经过RNA抽提、DNase消化、反转录、qRT-PCR步骤即可确定慢病毒滴度。


Lenti-Pac?慢病毒滴度检测试剂盒产品优势:


能够判断慢病毒是否包装成功;

准确测定病毒拷贝数,以确保细胞转导和基因表达的效率;

提供滴度检测过程从病毒的RNA提取到qPCR检测所需要的试剂。


货号名称规格
LT005Lenti-Pac HIV qRT-PCR Titration Kit
慢病毒滴度检测试剂盒
20次RT+50次qPCR
LT00640次RT+100次qPCR


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